Extraktion und chromatographische Analytik von freien Fettsäuren aus Stuhlproben

HONIGHÄUSCHEN (BONN) – Die Zusammensetzung von Säuglings-Formulanahrung sowie die Positionierung der Palmitinsäure innerhalb des Triacylglycerolmoleküls können einen Einfluss auf die Stuhlkonsistenz der Säuglinge haben (Innis et al., 1994). Ein erhöhter sn-2-Palmitinsäure-Gehalt (Palmitinsäure an mittelständiger sn-2-Position des Glycerolmoleküls verestert) in der Säuglings-Formulanahrung steht im Zusammenhang mit einer Reduktion der Stuhl Fettsäuren-Seifen sowie weicherer Stuhl-Konsistenz bei Säuglingen mit Konstipationsbeschwerden (Bongers et al., 2007). Ziel dieser Arbeit war es, eine Methode zur Extraktion und chromatographischen Analyse von freien Fettsäuren aus Säuglingsstuhlproben zu etablieren und zu validieren. Da die Gewinnung von Säuglingsstuhlproben in den ersten Lebensmonaten aufgrund von geringen Stuhlmengen eine Herausforderung darstellt, wurde die Analyse mit so geringen Stuhlprobenmengen wie möglich durchgeführt. Es konnte eine Einwaage von 0,1 g Trockenstuhl für die Bestimmung der Gesamt-Fettsäuren sowie eine Einwaage von 0,2 g Trockenstuhl für die Analyse der unverseiften Fettsäuren erreicht werden. Weiterhin sollte die Soxhlet-Analysedauer von 16 Stunden verkürzt werden, um zukünftig mehr Proben in kürzerer Zeit analysieren zu können. Allerdings wurde aufgrund der schlechteren VK-Werte bei einer verkürzten 12-stündigen Soxhlet-Analysezeit für die Methodenetablierung die 16-stündige Soxhlet-Extraktion gewählt. Weiterführend wurde die etablierte Methode im Rahmen einer klinischen Interventionsstudie eingesetzt. Ziel der Studie war es, die Ausscheidung der Fettsäuren-Seifen, organische Säuren einschließlich kurzkettigen Fettsäuren und das Fettsäurenprofil der Erythrozytenmembran von Säuglingen, die entweder mit einer modifizierten Formulanahrung (Verum) mit einem erhöhten sn-2-Palmitinsäure-Gehalt (25,4 % Palmitinsäure in sn-2-Veresterung), unter Zugabe von 0,5 g/100 ml GOS, oder einer Standard-Formularnahrung (Kontrolle) (< 10 % Palmitinsäure in sn-2-Veresterung innerhalb des Glycerolmoleküls) gefüttert worden sind, zu untersuchen. Parallel hierzu wurde eine nicht-randomisierte Gruppe mit Muttermilch-ernährten Säuglingen untersucht. Die Stuhlproben wurden im Alter von 37 – 47 Lebenstagen (Studientag 2 = ST2) gesammelt und gefriergetrocknet. Die Lipidextraktion der Gesamt-Fettsäuren erfolgte mit Hilfe einer Petrolether/Salzsäure-Mischung. Nach Trennung der Petrolether/Fettsäuren-Schicht und Trocknung wurde die Probe in Chloroform gelöst und für die Derivatisierung vorbereitet. Die unverseiften Fettsäuren wurden mit Hilfe der Soxhlet-Anlage 16 Stunden mit Petrolether extrahiert. Nach Trocknung der Probe wurde diese in Chloroform gelöst und ebenfalls für die Derivatisierung vorbereitet. Zur Umwandlung der Fettsäuren in Methylester wurden die Proben zuerst mit Chloroform behandelt und mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie separiert. Die Banden der freien Fettsäuren wurden in ein Röhrchen gefüllt und mit dem Methylierungsreagenz (Methanol/Salzsäure) bei 95 °C für vier Stunden inkubiert. Am Ende konnten die Proben in Heptan gelöst und mit Hilfe der Gaschromatographie analysiert werden (Varian medical systems, Palo Alto, USA). Die verseiften Fettsäuren wurden aus der Differenz der Gesamt- und unverseiften Fettsäuren arithmetisch berechnet. Die Fettsäuren-Seifen wurden in µmol pro g Trockenstuhl dargestellt. Für die Analyse der organischen Säuren einschließlich kurzkettigen Fettsäuren wurden die Proben mit Wasser und Acetonitril behandelt und nach anschließender Filtration mit Hilfe der HPLC analysiert. Die venösen Blutproben wurden im Alter von 3 – 10 Lebenstagen (Studientag 1 = ST1) und an ST2 gesammelt, um sicherzustellen, dass die modifizierte Formulanahrung mit hohem sn-2-Palmitinsäure-Gehalt keinen negativen Effekt auf die essenziellen Fettsäuren hatte. Die Fütterungsmengen der Formula-Gruppen wurden zu ST2 und ST3 (Studientag 3 = Alter von 77 – 91 Lebenstagen) und die anthropometrischen Messungen an ST1 und ST3 erhoben. Die Ergebnisse zeigten, dass es keine Unterschiede hinsichtlich der Fettsäuren-Seifen-, Palmitin-Seifen-, Gesamt-Fettsäuren- und organische Säuren- einschließlich SCFAs-Konzentrationen in den Stuhlproben zwischen der Verum- und Kontroll-Gruppe gab. Allerdings wies die MM-Gruppe signifikant niedrigere Konzentrationen der ausgeschiedenen Fettsäuren-Seifen, Palmitinsäure-Seife, Gesamt-Fettsäuren sowie der SCFAs Essig- und Propionsäure und höhere Konzentrationen der Ameisen- und Brenztraubensäure im Vergleich zur Verum- und Kontroll-Gruppe auf. Der Gehalt der LA (C 18:2n6) und ALA (C 18:3n3) stieg in den Erythrozyten der Säuglinge in allen drei Gruppen von ST1 zu ST2 signifikant an. Die Kontroll-Gruppe wies signifikant niedrigere AA und DHA Konzentrationen im Vergleich zur MM-Gruppe zu ST2 auf. Die Säuglinge, welche eine modifizierte Formula mit erhöhtem sn-2-Palmitinsäure-Gehalt unter Zugabe von 0,5 g/100 ml GOS erhielten, zeigten nicht die erwarteten positiven Effekte bezüglich der Fettsäuren-Zusammensetzung im Stuhl. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der entwickelten Methodik für die durchgeführte klinische Interventionsstudie ausreichend sind. Eine Verbesserung der hier entwickelten Methodik würde zu keiner signifikanten Verbesserung der klinischen Interventionsstudieergebnisse führen.

 

Über „Extraktion und chromatographische Analytik von freien Fettsäuren aus Stuhlproben“

Das vorliegende Sachbuch zu Themen aus Umwelt und Natur „Extraktion und chromatographische Analytik von freien Fettsäuren aus Stuhlproben“ wurde erarbeitet und verfasst von Maroula Lambidou. Dieses Sachbuch erschien am 23.09.2021 und wurde herausgegeben von VVB Laufersweiler Verlag.

Bücher wie „Extraktion und chromatographische Analytik von freien Fettsäuren aus Stuhlproben“ sind im Onlineshop des Honighäuschens bestellbar. Online bestellte Fachbücher zur Imkerei und zu anderen Themen der Umwelt und des Artenschutzes sind zu den üblichen Öffnungszeiten auch direkt im Buchladen Bundesamt für magische Wesen in Bonn, der Stauhauptstadt von Nordrhein-Westfalen abholbar und werden auf Wunsch verschickt.

Das Thema Bienensterben, Rückgang von Insekten und allgemeines Artensterben ist in aller Munde und das Honighäuschen als frühere Bioland Imkerei hat sich von Anfang an daran beteiligt. Mehr als 35 Jahre Imkereierfahrung nahmen ihren Anfang 1982 mit den ersten eigenen Bienen.

Der zehnjährige Junge, der 1977 einem Hamburger Imker über die Schulter schaute; der Fünfzehnjährige, der mit der Imkerei in Zeiten begann, in denen es noch keine Varroamilbe gab; der achtzehnjährige Fahrschüler, der lernte, dass man die Windschutzsscheibe seines Autos nach einer längeren Fahrt von Insekten säubern muß; der zwanzigjährige Student, der für seine Bienen einen Platz in Bonn suchte; der dreißigjährige Berufsimker, der seinen Bienen quasi eine Gutenachtgeschichte erzählte und sich den Kopf zerbrach, wie man die Umwelt mit ihren Bienen, Wespen, Schmetterlingen und andere blütenbesuchenden Insekten vor den Machenschaften der Agrargiftindustrie und der Gleichgültigkeit agrarindustriehöriger Politiker schützt; der Imker, der nicht nur auf dem Weihnachtsmarkt Bonn die Öffentlichkeit suchte, um bei Führungen an den Bienen auf dem Dach der Bundeskunsthalle zu erleben, dass Kinder (und deren Helikoptermuttis!) Angst vor Schmetterlingen hatten, bis hin zum Begleiter von Forschungsprojekten zu den Riesenhonigbienen Nepals oder den Killerbienen Afrikas, stellt fest, dass etwas sehr im Argen liegt in unserem Umgang mit der Umwelt.

Es sollte jedem bewußt sein, dass die Haltung „Natur ja, aber bitte woanders!“ nicht in Ordnung ist. Machen wir so weiter, werden wir Insekten und andere Tiere irgendwann nur noch in Foto- und Bildbänden finden.

Die wunderschöne Welt der Natur

Jeder Griff zum Unkrautvernichtungsmittel, um den Rasen „schön ordentlich“ zu halten, bevor „die Nachbarn was sagen“; jeder überflüssige Einsatz zur Bekämpfung eines Wespennestes – ja, auch damit habe ich zu tun und berate gern, wenn ein Hornissennest in einem Kindergarten oder ein Wespennest in Bonn den Haus- und Gartenbesitzer vor Fragen stellt, sollte begleitet sein von der Frage, ob das wirklich sein muß.

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Aber nach wie vor stehe ich Ihnen auch gern zu einem Gespräch oder zu einer Beratung im Umgang mit Bienen, Wespen, Hornisse, Wildbienen und Hummeln zur Verfügung, wenn Sie Fragen haben. Besuchen Sie uns in Bonn im Bundesamt für magische Wesen.

Und natürlich gibt es auch weiterhin Honig, Bienenwachskerzen und Met bei uns und zwar das ganze Jahr – nicht nur zu Weihnachten.